微流控分析芯片是通過微加工技術(shù)將微管道、微泵、微閥、微儲液器、微電極、微檢測元件、窗口和連接器等功能元器件，像集成電路一樣集成在芯片材料上的微全分析系統(tǒng)。微流控分析技術(shù)已經(jīng)成為重要的化學(xué)及生物分析手段，其分析的優(yōu)越性(材料及試劑的低耗、原位分析、快速實時等)在細(xì)胞、分子水平檢測得以應(yīng)用和展現(xiàn)，尤其在細(xì)胞研究及應(yīng)用方面，由于微流道尺度與細(xì)胞良好的相容性，可以在體外實現(xiàn)對體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境的高度模擬，所以在生命科學(xué)中的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞操縱、試樣處理及細(xì)胞檢測方面有諸多應(yīng)用，成為細(xì)胞及單個細(xì)胞實時檢測和研究的新平臺。許多微流控芯片研究致力于設(shè)計創(chuàng)造多功能微系統(tǒng)整合細(xì)胞檢測中的分析步驟，從而在微系統(tǒng)上實現(xiàn)細(xì)胞特別是單細(xì)胞生理、病理及藥理等方面的研究。微流控芯片自身的設(shè)計和制作技術(shù)、芯片上細(xì)胞研究模型和方法的建立離不開檢測方法和技術(shù)的探索與應(yīng)用。

目前，微流控芯片上細(xì)胞研究中的檢測技術(shù)主要采用光學(xué)檢測和電化學(xué)檢測。光學(xué)檢測靈敏度高、設(shè)備簡單且易于與微流控芯片相結(jié)合，更有潛力應(yīng)用于活細(xì)胞實時檢測。微流控芯片上光學(xué)檢測方法依原理可分為熒光檢測、化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光檢測、拉曼光譜檢測、折射率檢測、熱透鏡光譜檢測和表面等離子激元共振檢測等。本文對近年來微流控芯片上細(xì)胞研究中的光學(xué)檢測方法與技術(shù)進(jìn)行綜述。

1熒光(Fluorescence)檢測

熒光化合物在一定的激發(fā)波長下可以釋放特定的熒光，而其它物質(zhì)對特定熒光物質(zhì)的信號交叉干擾很小，故而利用熒光光譜可以靈敏地檢測熒光物質(zhì)。熒光檢測靈敏度高且易與微流控芯片相結(jié)合，從而使其成為微流控技術(shù)中最主要的光學(xué)檢測方法之一。

熒光檢測初時主要通過對細(xì)胞成像顯示檢測芯片上細(xì)胞的生長和活動狀況，后來逐漸應(yīng)用到細(xì)胞膜和細(xì)胞組分的研究中。Yager研究組在微流控芯片上對大腸桿菌進(jìn)行溶膜、提取細(xì)胞中β-半乳糖苷酶，并用熒光標(biāo)記底物試鹵靈-半乳吡喃糖苷(RBG)檢測β-半乳糖苷酶含量，最大可以提取到165nmol/L的β-gal，應(yīng)用不同的流速設(shè)置還可以用于分析其它細(xì)胞組分。Farinas等在微流控芯片上用熒光檢測分析人T淋巴細(xì)胞的離子通道活動情況，用毛細(xì)管從微培養(yǎng)板中吸取測試樣本與THP-1細(xì)胞混合并進(jìn)一步與微流道中的電勢敏感熒光染料混合，利用膜去極化和超極化時陰離子染料DiBAC4和陽離子染料Syto62的熒光比率變化測量單細(xì)胞膜電勢，相對于膜片鉗技術(shù)而言，是一種簡單的細(xì)胞離子通道活力檢測的方法。

激光誘導(dǎo)熒光(LIF)可以精確控制激發(fā)光的參數(shù)，其敏感性更高，檢出限一般在10－13～10－9mol/L之間，因而用LIF進(jìn)行微流控上細(xì)胞及其裂解物的檢測非常普遍。微流控芯片上LIF檢測有非共聚焦和共聚焦檢測系統(tǒng)兩種。激光共聚焦技術(shù)可以有效減小樣品照射體積，從而減小散射光對靈敏度的影響，因而共聚焦檢測系統(tǒng)的信噪比(SNR)較非共聚焦系統(tǒng)高。李永新等用LIF檢測微流控芯片上電泳分離的四種病原微生物DNA，可檢測出1×102cfu/mL的病原菌。Hellmich等用共聚焦LIF-微流控芯片系統(tǒng)(見圖1)檢測單細(xì)胞的裂解組分。系統(tǒng)在可見光區(qū)可檢測1×10－13mol/L的熒光素;在紫外區(qū)內(nèi)利用Trp、Tyr和Phe3種氨基酸的LIF特性完成對蛋白質(zhì)的分離和無熒光標(biāo)記檢測。他們后續(xù)通過減小入射激光的功率和校正共聚焦的針孔將蛋白質(zhì)和氨基酸的檢出限降低了2個數(shù)量級;再通過在PDMS中整合炭黑顆粒和涂覆基于聚氧乙烯的三嵌段共聚物F108層芯片表面修飾進(jìn)一步提高了微流道中蛋白質(zhì)的分離效率和LIF檢測的敏感度，對氨基酸的檢出限達(dá)到2．5×10－8mol/L，并在芯片上實現(xiàn)對單細(xì)胞中低濃度蛋白質(zhì)的無標(biāo)記檢測。

圖1紫外和可見激光誘導(dǎo)熒光檢測系統(tǒng)

許多研究者在微流控?zé)晒鈾z測系統(tǒng)的小型化方面做了有益嘗試，將光源和其它微設(shè)備組件整合，發(fā)展出各種小型化系統(tǒng)用于細(xì)胞及生物分子分析。Joo等將一個發(fā)光二極管(LED)、一個固態(tài)光電倍增管(SSPM)、聚電解質(zhì)凝膠電極(PEGs)與玻璃微流控芯片組裝在體積15cm×10cm×10cm的微系統(tǒng)中，這個便攜式的微流控細(xì)胞計數(shù)器可以簡單而快速地用電阻抗和熒光兩種檢測方式區(qū)分細(xì)胞和微粒子。Kuhn等設(shè)計出小型化的完全芯片整合的電光學(xué)陷阱，其激發(fā)能水平比常規(guī)光學(xué)陷阱低5個數(shù)量級，并運用熒光檢測完成大腸桿菌DNA的光漂白動力學(xué)研究。

微流控?zé)晒鈾z測靈敏性高，影響其自身靈敏度的因素主要來自瑞利和拉曼散射，同時芯片本身背景熒光的去除是提高檢測精確度的重要因素，此外檢測的小型化將更便于對細(xì)胞生理生化反應(yīng)的檢測。特異的熒光探針如量子點及免疫方法的結(jié)合，微流控表面圖案的設(shè)計可以省去對分析物的純化步驟，為芯片上實時、高靈敏度檢測提供思路。

2化學(xué)發(fā)光檢測和生物發(fā)光檢測

化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence，CL)或是生物發(fā)光(Bioluminescence，BL)的強度可以用于確定分析物的濃度，其靈敏度和選擇性高、線性反應(yīng)范圍寬，利于對分析物的定量分析。相比于LIF檢測，由于檢測不需要外來光源，因而減少了干擾，也簡化了設(shè)備對光源的要求，只需要一個光電倍增管和光電二極管作為檢測器即可。化學(xué)發(fā)光及生物發(fā)光檢測為微芯片檢測系統(tǒng)提供簡單而相對便宜的設(shè)備，符合芯片實驗室小型化發(fā)展趨勢。Heyries等利用化學(xué)發(fā)光在微流控芯片上實現(xiàn)對過敏特異抗體的檢測。用β-乳球蛋白、花生植物凝血素和人IgG3種蛋白質(zhì)作為過敏抗體檢測的捕捉試劑，經(jīng)過一種“PDMS彈性體大分子轉(zhuǎn)移”法固定在微流控芯片上。在經(jīng)流體實驗得到的最優(yōu)流速(20μL/min)條件下對過敏病人的血清進(jìn)行測定，均得到陽性免疫反應(yīng)。證明用微流控技術(shù)快速、靈敏地檢測蛋白質(zhì)的小型化學(xué)發(fā)光ELISA的可行性。

電化學(xué)發(fā)光(ECL)是由電化學(xué)反應(yīng)刺激而產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光。ECL不但保持了CL的優(yōu)點，而且光釋放反應(yīng)的時間和位點也可以由電化學(xué)反應(yīng)控制。ECL試劑的電化學(xué)循環(huán)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光試劑信號釋放，可以實現(xiàn)低檢出限檢測。檢測采用較多的是聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)2+3反應(yīng)體系，也有許多采用三胺衍生物探針進(jìn)行羧酸類物質(zhì)的ECL檢測。Hosono等組裝了一個由PDMS基底流道和玻璃基底三電極組成的微流控系統(tǒng)，可以完成微流道傳輸、溶液混合和ECL檢測。通過控制流道中的兩個金電極傳輸并混合氨基酸溶液和聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)2+3，再由混合通道中的鉑電極施加電場引發(fā)ECL進(jìn)行檢測。檢測5種氨基酸Leu，Val，Pro，Lys和His，顯示ECL的強度與氨基酸濃度正相關(guān)，其中Pro的檢出限達(dá)到nmol/L級。之后在此系統(tǒng)中引入自動化閥控制溶液混合并由芯片上電極電勢調(diào)節(jié)pH值的恒定，提高了自控性。Pittet等用印刷電路板(PCB)技術(shù)設(shè)計電極和封裝環(huán)氧基質(zhì)在微流控芯片上進(jìn)行ECL檢測，降低了系統(tǒng)成本。Naseri等則開發(fā)了一種微流控芯片上注塑聚苯乙烯導(dǎo)電電極的技術(shù)，通過在其表面電子束蒸金或銀及電化學(xué)形成AgCl形成不同的電極，芯片系統(tǒng)可用于ECL和伏安法電化學(xué)檢測。

微流控芯片上BL檢測則利用細(xì)胞自身的發(fā)光性質(zhì)，如利用細(xì)胞中具有發(fā)光性質(zhì)的酶，然后依照外界物質(zhì)對其催化產(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物的BL信號的影響而檢測。Elman等首次開發(fā)一個包含有全細(xì)胞傳感器、微光電機械系統(tǒng)(MOEMS)調(diào)幅器和固相光探測器的芯片系統(tǒng)(見圖2)。在細(xì)胞傳感器模塊中應(yīng)用轉(zhuǎn)化了lac啟動子質(zhì)粒的E．Coli做為細(xì)胞傳感模塊，用IPTG(半乳糖苷酶基因的誘導(dǎo)劑)評價整個系統(tǒng)的檢測能力，能檢測到0．1mmol/LIPTG作用下細(xì)胞的BL，證明其應(yīng)用于細(xì)胞毒性檢測的潛力。Yoo等利用微流控芯片上固定的生物發(fā)光細(xì)菌檢測細(xì)胞毒性物質(zhì)。用聚乙烯乙醇-苯乙烯吡啶(PVA-SbQ)在芯片上固定細(xì)胞，生物發(fā)光隨著細(xì)胞氧化損傷程度增加而加強，0．88mmol/L過氧化氫的加入使得生物發(fā)光強度增加10倍。Liu等則設(shè)計了“Y”型微通道用于樣本制備、分離并進(jìn)行與ATP及ATP偶聯(lián)代謝的熒光素-熒光素酶BL檢測。定量分析表明ATP呈現(xiàn)動態(tài)的線性范圍，檢出限低至亞微摩爾。

CL和BL檢測選擇性和特異性高，但是只適合于特定化學(xué)發(fā)光試劑和細(xì)胞的研究，微流控芯片的設(shè)計中多個芯片層及分析檢測模塊的整合很重要。此外，ECL中電極的排布應(yīng)避免分離電極的影響，由此增加了芯片設(shè)計和制作的復(fù)雜度;選擇更廣泛的檢測試劑將會擴(kuò)大檢測的應(yīng)用范圍。

圖2整合的微光電機械系統(tǒng)(MOEMS)(a)和細(xì)胞傳感生物傳感芯片實驗室系統(tǒng)(b)

3.拉曼(Raman)檢測

拉曼光譜用來研究系統(tǒng)中分子的震動、轉(zhuǎn)動及其它低頻率震蕩模型，這些光譜提供的“化學(xué)指紋”可以用來鑒定特定分析物。不同于分子紅外光譜，極性分子和非極性分子都能產(chǎn)生拉曼光譜，而且由于水分子不會對其光譜產(chǎn)生影響，拉曼光譜不需要分析物絕對干燥。

激光誘導(dǎo)拉曼顯微術(shù)結(jié)合微流控芯片適于對微環(huán)境下樣本的混合、結(jié)構(gòu)性質(zhì)的原位探測，結(jié)合應(yīng)用納米探針、染料標(biāo)記、流道表面修飾、光學(xué)鑷子等技術(shù)對細(xì)胞及其代謝物無標(biāo)記實時監(jiān)測，微芯片拉曼檢測是細(xì)胞分選、細(xì)胞藥理、病理研究的新平臺。Ramser等將共聚焦微拉曼裝置、光學(xué)鑷子及微流控系統(tǒng)相結(jié)合檢測單個紅細(xì)胞在環(huán)境刺激中其血紅蛋白的氧循環(huán)變化過程。采集微流道中光鑷束縛下紅細(xì)胞在近紅外區(qū)的拉曼共振光譜，光譜的變化與血紅蛋白在光誘導(dǎo)作用下的轉(zhuǎn)換變化相同。這使得細(xì)胞內(nèi)氧合作用循環(huán)的實時檢測和光誘導(dǎo)化學(xué)效應(yīng)的觀察成為可能。黃超等用類似體系檢測紅細(xì)胞，證明與常規(guī)方法相比，微流控拉曼檢測對正常及病例紅細(xì)胞的區(qū)分度更好，檢測進(jìn)程更快。Huang等利用吡啶二羧酸鈣(Ca-DPA)在1017cm－1的特異拉曼光譜，檢測光鑷束縛下桿菌類單個孢子中Ca-DPA含量變化，同時也研究了SpoVA蛋白在桿菌孢子化的過程中對Ca-DPA攝入的作用，在桿菌細(xì)胞孢子化的研究方法上有所創(chuàng)新。此外，Lau等開發(fā)了一套拉曼激活細(xì)胞分選(RACS)體系進(jìn)行無標(biāo)記細(xì)胞識別和自動化細(xì)胞連續(xù)分選，分選了兩種白血病細(xì)胞系。Wang等則利用相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)結(jié)合PDMS微流控裝置(見圖3)進(jìn)行流式細(xì)胞計量。在芯片上橫向聚焦液體核心掃描微流道中流動目標(biāo)，對鼠脂肪細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量測定。CARS有很強的反斯托克斯強度，其藍(lán)移導(dǎo)致其很容易與熒光分離，而且有確定的散射方向，比普通拉曼散射更易得到理想的檢測信號，故而CARS細(xì)胞計量術(shù)是一種較好的具有震動選擇性的定量分析模式。

圖3CARS細(xì)胞計量檢測系統(tǒng)和芯片上流體聚焦效應(yīng)

表面加強拉曼散射(SERS)顯微術(shù)通過表面共振加強技術(shù)可進(jìn)一步提高拉曼光譜的靈敏度，SERS不僅可以對樣品進(jìn)行光譜研究，還能進(jìn)行功能性成像，提高了分子分析的信息量。Zhang等將微流控和SERS及共聚焦顯微分光鏡結(jié)合原位檢測單個CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞的光譜，注入伊屋諾霉素連續(xù)流并監(jiān)測細(xì)胞在藥物誘發(fā)下Ca2+流的實時拉曼光譜反應(yīng)。這種方法可用于研究細(xì)胞對外界條件刺激下的響應(yīng)。Li等在硅基質(zhì)上刻蝕納米結(jié)構(gòu)形成模板，用此模板構(gòu)建具有納米結(jié)構(gòu)的PDMS微流道，然后在其上沉積銀膜，形成納米阱(nanowell)結(jié)構(gòu)，實驗證明在納米阱上AgSERS基質(zhì)的拉曼散射信號比普通PDMS上平滑Ag鍍層的信號強107倍。此外，在微流道中形成微液滴再進(jìn)行SERS檢測也是一種有效的定量分析方法，細(xì)胞和微生物可被包被到微液滴中，然后進(jìn)行實時SERS檢測和定量分析。Popp等用SERS檢測微流道中液/液片流中的分析物，微片流的體積小至180nL。這種方法克服了常規(guī)粘附膠體/分析聚合物在光學(xué)玻璃上留下的曲線痕跡(即記憶效應(yīng))的影響，提高了定量分析的重復(fù)性。進(jìn)一步地用同位素標(biāo)記液液片流作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行煙堿和吡啶SERS光譜的定量分析。這種微流道中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的建立進(jìn)一步提高了SERS光譜分析的可重復(fù)性和對照性。

拉曼光譜的空間和時間分辨率高，適于對細(xì)胞及其生物分子的實時監(jiān)測，微流道表面的處理和樣液處理方式非常重要，檢測時要選擇微流控芯片的基質(zhì)種類和厚度及檢測波長以減小背景熒光干擾。

4.折射率(Refractiveindex，RI)檢測

材料的折射率是電磁波在真空中的傳播速度與它在介質(zhì)中的傳播速度的比值，是一個衡量電磁波在材料內(nèi)部傳播減慢的物理量。折射率檢測對于環(huán)境溫度、壓力或是流速非常敏感，與微流控設(shè)備結(jié)合并精確地控制外部條件后可以檢測多種分析物，尤適于熒光等其它方法不能檢測的非離子、無紫外吸收、無熒光的物質(zhì)如蔗糖、PEG等的檢測。

細(xì)胞的折射率是一個顯著的細(xì)胞生物物理性質(zhì)，折射率依細(xì)胞和細(xì)胞核的大小及表面性質(zhì)的不同而有差異。折射率也對外圍的緩沖液非常敏感，對細(xì)胞RI的檢測有潛力用于癌癥和疾病的診斷。Lue等在微流道上對細(xì)胞用希爾伯特相顯微鏡法進(jìn)行定量相位顯像提取，測量培養(yǎng)細(xì)胞的平均折射率。而許多有效的RI檢測是在微流控芯片上構(gòu)造法布里-珀羅諧振腔，在其中固定單個細(xì)胞，然后依照細(xì)胞自身性質(zhì)的不同及測量條件的改變而區(qū)分不同單細(xì)胞。依此方法，Shao等在微流控芯片上實現(xiàn)了紅細(xì)胞、白細(xì)胞和酵母細(xì)胞的區(qū)分，也通過正常淋巴細(xì)胞和兩類淋巴癌細(xì)胞系(Oswald和1771)間細(xì)胞核的差異導(dǎo)致的內(nèi)腔式光譜的不同結(jié)合有效折射率模型計算區(qū)分細(xì)胞。Liu領(lǐng)導(dǎo)的研究組利用相同的原理設(shè)計小型RI檢測的微流控芯片并進(jìn)行對細(xì)胞RI檢測的研究。檢測系統(tǒng)由微芯片上微通道、小角膜接觸鏡和外部空腔激光器組成。光源是尺度為215μm×300μm×100μm的激光二極管，用鍍金的鏡面構(gòu)建外圍空腔，設(shè)計了一個微鏡頭使得激光器可以聚焦到單個細(xì)胞上。實驗結(jié)果證明，5種癌細(xì)胞的折射率(1．392～1．401)高于正常細(xì)胞的折射率(1．35～1．37)。隨后他們［47］在微流控芯片上構(gòu)建光柵共振腔，用光纖引導(dǎo)激光進(jìn)行單個活細(xì)胞RI檢測，微流控芯片集成細(xì)胞注入、液滴分離、緩沖液調(diào)節(jié)和纖維布拉格光柵(FBG)功能(見圖4)。這種光學(xué)陷阱技術(shù)減小了不確定因素和對細(xì)胞的損傷，使得單細(xì)胞檢測簡便、無損。類似的，St-Gelais等發(fā)展了一個集成有垂直刻蝕的硅布拉格反射鏡的微芯片RI傳感器，進(jìn)行芯片上法布里-珀羅諧振光譜RI檢測，得到907nm/RIU敏感度和1．7×10－5RIU的分辨率。

圖4生物芯片和纖維布拉格光柵

此外，Ymeti等將一個光學(xué)四通道小干涉儀整合在微流控系統(tǒng)中，形成一個小型光學(xué)傳感系統(tǒng)。4個微流道為進(jìn)樣分析通道，而光學(xué)四通道小干涉儀為傳感窗口。在相互反應(yīng)長度為4mm的情況下，折射率的分辨率相當(dāng)于6×10－8，對應(yīng)于蛋白質(zhì)的質(zhì)量覆蓋分辨率為20fg/mm2。Kim等通過掃描玻璃樣本中的激光脈沖串將光學(xué)波導(dǎo)結(jié)構(gòu)整合到微流道中進(jìn)行單個紅細(xì)胞處理和折射率及熒光檢測。

RI檢測避免了熒光標(biāo)記和化學(xué)修飾對細(xì)胞的影響，適于對細(xì)胞自然狀態(tài)的監(jiān)測。檢測對激光光源及對外部條件如溫度、壓力和流速的控制要求很高，特殊光學(xué)檢測結(jié)構(gòu)的設(shè)計及光纖等的應(yīng)用使得微流控RI檢測系統(tǒng)更接近于芯片實驗室的概念。

5.熱透鏡顯微(Thermallensmicroscopy，TLM)檢測

熱透鏡技術(shù)有兩個激光器產(chǎn)生兩柱激光，其中激發(fā)光柱激發(fā)樣本，探針光柱測量折射率的變化。由于光吸收分子的濃度與熱透鏡效應(yīng)成線性相關(guān)關(guān)系，所以通過測量由于TLS導(dǎo)致的探針光柱的會聚或分散可以進(jìn)行定量分析。TLM適于結(jié)合微流道檢測，因為微流控芯片中矩形流道中的檢測比在圓形的毛細(xì)管中更容易校準(zhǔn)。Kitamori及其研究組在微流控芯片上細(xì)胞培養(yǎng)及TLM檢測分析方面多有建樹。

微流控芯片上細(xì)胞培養(yǎng)和對流體的控制，可以高度模擬細(xì)胞在體內(nèi)的真實環(huán)境，而TLM可以實時無標(biāo)記地監(jiān)測細(xì)胞對外界刺激條件的響應(yīng)。Jang等用TLM在微流控芯片上研究了流體切應(yīng)力對成骨細(xì)胞分泌表達(dá)蛋白的影響。在連續(xù)灌流的玻璃微芯片系統(tǒng)中培養(yǎng)可表達(dá)GFP標(biāo)記基因的鼠MC-3T3E1成骨細(xì)胞，用TLM測量芯片上堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)，證明在微流道中，切應(yīng)力(0．07dyne/cm2)作用能增加成骨細(xì)胞的GFP表達(dá)和分化;另外在含有骨形成蛋白2的分化培養(yǎng)基中，微流道中細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALP活性達(dá)到常規(guī)48孔板靜態(tài)培養(yǎng)下活性的10倍。此微芯片細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能自動化長時期(10天)監(jiān)測細(xì)胞并進(jìn)行成骨細(xì)胞分化分析。Sato等用石英玻璃微流控芯片培養(yǎng)鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞模擬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，然后將含有神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的溶液注入到芯片上刺激培養(yǎng)的神經(jīng)元釋放逆行信使分子花生四烯酸，之后用UV-TLM檢測分析。測量的信號強度依賴于谷氨酸溶液的濃度，而且神經(jīng)元釋放逆行信使分子也與谷氨酸溶液的濃度相關(guān)。這個系統(tǒng)適合于細(xì)胞釋放超痕量化學(xué)物質(zhì)的時間變化監(jiān)測。

微流控芯片TLM檢測系統(tǒng)還可以模擬和監(jiān)測細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境下對多種刺激條件的細(xì)胞響應(yīng)，用于代謝和藥物篩選。Goto等在玻璃芯片上培養(yǎng)巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，通過控溫設(shè)備控制芯片3個不同區(qū)域溫度不同，然后用TLM監(jiān)測細(xì)胞在脂多糖刺激下NO的釋放過程(見圖5)。與常規(guī)方法相比，對于NO的檢出限從1×10－6mol/L降低到7×10－8mpl/L，檢測時間由24h縮短到4h。

TLM由于其高檢測靈敏性和高分辨率，還用于監(jiān)測微流道上單個細(xì)胞表面及內(nèi)部分子的分布情況，并且可以定量檢測識別目標(biāo)分子。Tamaki等［58］用小型TLM結(jié)合微芯片監(jiān)測成神經(jīng)細(xì)胞瘤-神經(jīng)膠質(zhì)瘤雜交細(xì)胞中細(xì)胞色素C在凋亡過程中由線粒體到胞質(zhì)溶膠中的分布過程。在芯片微槽(體積為1μL)中培養(yǎng)細(xì)胞以模擬細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境，在微流道進(jìn)行流體操縱和檢測，細(xì)胞色素C的含量約為10－20mol。此外Kakuta等發(fā)展了一種芯片上TLM免疫分析檢測方法，在凝膠上檢測了腦鈉素與其抗體相互作用的結(jié)合活性。

TLM檢測極其靈敏，與微流控結(jié)合對于細(xì)胞研究的模型已經(jīng)建立起來，可以對單個細(xì)胞無創(chuàng)、實時檢測，將是微系統(tǒng)的一個重要發(fā)展應(yīng)用技術(shù)。檢測時需要精細(xì)的光學(xué)校準(zhǔn)以達(dá)到檢測的最佳配置。

圖5基于微芯片的生物分析系統(tǒng)

6.表面等離子激元共振(Surfaceplasmonresonance，SPR)檢測

微流控SPR檢測最主要的特點是對界面上生物分子相互作用的無標(biāo)記實時監(jiān)測，通過對生物反應(yīng)過程中SPR的動態(tài)變化監(jiān)測獲取生物分子相互作用的特異信號。檢測對象一般是具有配體和受體特異結(jié)合性質(zhì)的核酸、蛋白質(zhì)、酶及抗體等生物分子，尤其適合對免疫反應(yīng)的過程監(jiān)測和定量分析，這種對分子特異反應(yīng)的實時監(jiān)測也用于細(xì)胞的檢測和傳感。

微流控芯片對流體的控制可以減少反應(yīng)時間和樣本消耗，同時增加配體與膜表面受體的結(jié)合特性，SPR圖像實時監(jiān)測生物分子復(fù)合體的形成及變化。Garcia-Aljaro等用微流控SPR傳感器檢測廢水中的大腸桿菌噬菌體。利用卵白素-生物素將噬菌體宿主E．coliWG5固定在金傳感芯片上，然后加入大腸桿菌噬菌體檢測SPR的特異信號。噬菌體-宿主間相互作用使E．coliWG5裂解使得傳感芯片表面質(zhì)量密度增加，實時記錄相應(yīng)的SPR信號進(jìn)行檢測，檢出限約為102PFU/mL。Lei等將微泵、微通道和SPR生物傳感器集成在一個PMMA芯片上(見圖6)，用SPR信號監(jiān)測芯片上RPMI-1640培養(yǎng)基中鼠L929細(xì)胞在胰酶加入前后的細(xì)胞粘附與脫附過程，整個體系對于監(jiān)測細(xì)胞在藥物作用下活力的變化非常實用，而且是研究溶液體系的變化對特定生物分子間相互作用影響的有效平臺。

SPR檢測另外一個特點是可以檢測溶液中可被捕獲或是沉積在界面表面上的分子及細(xì)胞，因而無需分離純化溶液中的特異分析物。Kim等在微芯片上集可表達(dá)GST-GFP(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶綠色熒光蛋白)的E．Coli細(xì)胞培養(yǎng)、溶膜、及GST-GFP-谷胱甘肽酰金表面親和純化及SPR圖像檢測于一體，可在芯片上直接進(jìn)行SPR檢測，省去了GST-GFP的純化步驟，整個檢測敏感而且特異。類似地，Yang等在微流道中快速定量分析唾液中皮升級的IL-8，依照其含量輔助診斷口腔癌細(xì)胞的存在，對唾液中IL-8的檢出限為184pmol/L。另外SPR只檢測與抗體結(jié)合的細(xì)胞，溶液中的細(xì)胞并不被檢測到，故適用于細(xì)胞在自然狀態(tài)下與表面相互作用的研究。Suraniti等用一個SPR抗體微陣列金薄層芯片選擇性地檢測血液中的淋巴細(xì)胞。在芯片表面固定吡咯偶聯(lián)的抗體，然后檢測流經(jīng)的血液樣品，采集不同細(xì)胞加入時陣列中抗體反射率的變化曲線和SPR圖像而實時監(jiān)測抗體對應(yīng)淋巴細(xì)胞的存在和數(shù)量。這個系統(tǒng)適用于細(xì)胞粘附動力學(xué)的研究及小型診斷系統(tǒng)的開發(fā)應(yīng)用。

圖6微流控SPR生物傳感器

此外在微流控芯片上運用陣列的方式可以同時進(jìn)行對照及平行樣實驗，在提高檢測通量的同時增加數(shù)據(jù)的質(zhì)量，因為芯片上內(nèi)部對照的設(shè)計可以校正反應(yīng)中非特異性結(jié)合及儀器漂變。Taylor等用前后十字交叉的方法制備3×3微陣列，并在其表面組裝液體栓雙層陣列進(jìn)行可尋址生物傳感，實時監(jiān)測不同蛋白質(zhì)的活力，整個分析檢測步驟都由SPR實時監(jiān)測便于對問題的發(fā)現(xiàn)及對反應(yīng)過程條件的優(yōu)化。

SPR檢測結(jié)合免疫學(xué)方法可以實時無標(biāo)記監(jiān)測細(xì)胞及其代謝物分子的變化，良好的表面反應(yīng)特性結(jié)合高特異的免疫學(xué)反應(yīng)，是微系統(tǒng)上細(xì)胞研究的良好平臺，芯片的制作要求較高，檢測需要對微流道表面鍍金膜或是與有金膜的芯片相結(jié)合，但是可以用于長時間的監(jiān)測。

7.總結(jié)與展望

微流控芯片的光學(xué)檢測方法多樣，而且一個芯片上可以集成多種檢測輔助手段，利用微流控芯片對細(xì)胞的操縱如流體切應(yīng)力作用、液滴化處理，再結(jié)合使用光學(xué)鑷子、納米技術(shù)、表面處理等手段往往可以使檢測更加靈敏和簡便;此外多種檢測技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用可以擴(kuò)展檢測的信號范圍和精度，顯示了微流控芯片檢測方法的多樣化和集成化。另外一個趨勢是向著小型化、便攜化發(fā)展，通過將光源、激發(fā)器、分析組件等檢測元件小型化，減小檢測的損耗和體積，發(fā)展出簡易的現(xiàn)場、實時檢測分析系統(tǒng)，向著芯片實驗室的方向發(fā)展。

微流控上細(xì)胞研究中光學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展使得細(xì)胞及生物分子的檢測進(jìn)入微米級、納米級及更小級別的檢測，對試劑的低耗、試樣的痕量、高精度分析使得微流控高通量檢測更加成熟，為生物微納系統(tǒng)的發(fā)展起著重要的促進(jìn)作用。但現(xiàn)有檢測方法對活細(xì)胞不同生命周期無創(chuàng)、實時、多成分的動態(tài)信息檢測和傳感仍有很大挑戰(zhàn)，新的檢測思路和方法仍需發(fā)展，同時芯片上細(xì)胞檢測及傳感應(yīng)當(dāng)越簡單實用越好，最好用圖像及顏色信息就可以分析。如僅僅采用CCD或是微流控光學(xué)微鏡(OFM)就可以完成信號采集，這樣利于對細(xì)胞的無損檢測及系統(tǒng)的小型化和便攜化，也更便于現(xiàn)場實時檢測。微流控芯片上微陣列、新敏感材料如卟啉、特異探針和形狀記憶聚合物等的應(yīng)用將為微流控系統(tǒng)上細(xì)胞檢測提供有益的思路和借鑒。另外小型化設(shè)備及微電子系統(tǒng)如小型二極管激光器、LED、光纖及ARM嵌入式系統(tǒng)的應(yīng)用將使檢測系統(tǒng)的成本更低廉，更便于使用。

文獻(xiàn)鏈接：DOI:10．3724/SP．J．1096．2010．01357

（文章來源:霍丹群劉振侯長軍* 楊軍 羅小剛 法煥寶 董家樂 張玉嬋 張國平 李俊杰 《微流控芯片光學(xué)檢測技術(shù)在細(xì)胞研究中的應(yīng)用與進(jìn)展》科學(xué)網(wǎng)科學(xué)網(wǎng)轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除）