最近，外泌體因其在疾病發(fā)展中發(fā)揮的重要作用而被公認為重要的疾病生物標志物。然而，從復(fù)雜體液中高效分離和富集外泌體繼續(xù)阻礙著外泌體臨床應(yīng)用的研究和應(yīng)用。在這項工作中，我們開發(fā)了一種基于雙切向流過濾的微流控裝置，用于從細胞上清液和人血清中分離外泌體。微流控裝置包含兩個模塊。每個模塊包括兩個聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 板，具有對稱的蛇形通道和一個孔徑為 200 nm 或 30 nm 的納米多孔膜，用于分離較大的囊泡、外泌體和游離生物分子。對稱蛇形通道中的雙切向流過濾設(shè)計大大增加了濾液與納米多孔膜的接觸面積，從而提高了分離效率，防止了膜的堵塞。與超速離心（UC）標準分離方法相比，基于微流控芯片的外泌體分離（Chip）具有儀器成本更低、耗材成本更低、時間更短（<120 min）、純度更高（82.8%）、回收率顯著提高（77.8%）等優(yōu)點。此外，由于無標記分離，微流控裝置收集的外泌體可直接用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析等下游分析。該芯片從臨床不同疾病患者血清中分離出的外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，與UC分離的外泌體相比，該芯片具有更豐富的疾病相關(guān)信息，證明了該芯片在未來臨床上具有良好的實用性。

細胞外囊泡是具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)的囊泡，幾乎可以由所有類型的細胞分泌，根據(jù)其大小和形成途徑，大致可分為外泌體、微囊泡和凋亡小體三類。在這些囊泡中，外泌體具有狹窄的尺寸分布，直徑范圍為 40 至 200 nm。外泌體廣泛存在于生物體液中，參與各種生理和病理過程，在細胞間通訊過程中發(fā)揮重要作用。腫瘤來源的外泌體是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的有效介質(zhì)，攜帶有關(guān)腫瘤細胞的特定分子信息，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)體和細胞內(nèi)代謝物。此外，越來越多的研究采用外泌體作為載藥載體來治療疾病，因為它們具有良好的生物相容性和較高的治療效率。因此，外泌體在臨床診斷和疾病治療中都是很有前途的工具。解決一些基本的技術(shù)問題，如外泌體的分離、富集、分子表征和工程化，是這些應(yīng)用中的重要任務(wù)。

然而，生物體液的組成通常非常復(fù)雜。例如，多種蛋白質(zhì)、核酸、囊泡和代謝物共存于人血清中。因此，從人血清中準確提取外泌體是一個巨大的挑戰(zhàn)。基于外泌體的密度、形狀、大小和特異性表面蛋白表達，已經(jīng)發(fā)展出許多分離方法，如基于密度的分離技術(shù)、基于大小的分離技術(shù)、基于免疫親和捕獲的技術(shù)、外泌體沉淀和基于微流控的分離技術(shù)。其中，無標記分離方法是近年來外泌體分離的趨勢，避免了標記劑的引入，減少了潛在的污染物，對外泌體的下游分子表征或工程化具有重要意義。到目前為止，超速離心一直是無標記外泌體分離的金標準。然而，由于其回收率低、純度低、操作繁瑣且需要昂貴的設(shè)備，難以滿足臨床需求。尺寸排阻色譜（SEC）是另一種以高產(chǎn)量和高純度快速分離外泌體的寶貴技術(shù)。然而，應(yīng)使用大量的緩沖溶液從分離柱中洗脫外泌體，這導(dǎo)致收集的外泌體濃度相對較低。如果需要下游分析，可能需要在UC的幫助下富集外泌體。近年來，微流控技術(shù)顯著推進了納米級顆粒的無標記分離。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了許多用于分離外泌體的微流控平臺，例如基于粘彈性、聲學(xué)、慣性、電和離心力的微流控平臺。使用微流控技術(shù)進行外泌體分離仍存在一些緊迫的問題，如器件制造的復(fù)雜性、成本仍然很高、需要特殊設(shè)備等。最近，基于膜過濾的微流控裝置被開發(fā)出來，通過納米多孔膜的尺寸篩分，將外泌體與體液中的其他成分直接分離。這些設(shè)備相對容易制造，制造和運營成本低。更重要的是，外泌體分離效率相對較高，產(chǎn)率較高，操作時間短，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。然而，大多數(shù)基于膜過濾的微流控裝置在外泌體分離中使用垂直過濾，導(dǎo)致系統(tǒng)中壓力過大并容易堵塞。最近，Qiao等人設(shè)計了一種基于切向流過濾的微流控芯片，用于從人血漿中分離外泌體[26]。切向流設(shè)計避免了垂直過濾壓力大、易堵塞等問題，蛇形通道設(shè)計允許液體與濾膜接觸面積更大。然而，在注入微流控裝置進行外泌體分離之前，仍應(yīng)使用高速離心對血漿樣品進行預(yù)處理。該裝置只能用于從蛋白質(zhì)污染物中分離外泌體，這嚴重限制了該裝置的廣泛應(yīng)用。

腫瘤來源的外泌體攜帶來自母體細胞的豐富信息，包括四跨膜蛋白、細胞信號分子、致癌蛋白、伴侶蛋白、細胞骨架、遺傳物質(zhì)、蛋白酶和抑癌基因。對于癌癥患者來說，腫瘤細胞分泌的外泌體將攜帶豐富的疾病相關(guān)信息。腫瘤細胞與腫瘤分泌的外泌體之間的相關(guān)性將成為癌癥診斷和后續(xù)治療的重要基石。蛋白質(zhì)是疾病發(fā)展中的主要功能分子。因此，更好地了解外泌體中的蛋白質(zhì)組成對于癌癥的評估至關(guān)重要。蛋白質(zhì)組學(xué)是揭示蛋白質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)和活性的有用方法。使用蛋白質(zhì)組學(xué)分析外泌體蛋白有望大大加深我們對外泌體和疾病的理解。

在此，我們設(shè)計了一種基于雙切向流過濾的微流控裝置，用于外泌體分離和富集。使用孔徑為 200 nm 和 30 nm 的多孔膜分選出 30 至 200 nm 之間的囊泡，可以分離和純化來自常規(guī)外泌體溶液（細胞培養(yǎng)上清液和人血清）的外泌體。比較了本方法與UC方法的回收率、純度、設(shè)備和耗材成本以及操作時間。此外，通過蛋白質(zhì)組學(xué)對兩種方法分離的肝臟相關(guān)疾病患者血清中的外泌體進行分析和比較，實現(xiàn)了對不同疾病類型的區(qū)分和可能的治療靶點的篩選。

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