按照芯片實驗室工作的一般流程，進樣和樣品預(yù)處理是首當(dāng)其沖的兩個環(huán)節(jié)，它們將原始樣品送入系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為適于運行的形式，并保證最終樣品處理結(jié)果的質(zhì)量和可靠性。從芯片實驗室概念提出至今，已經(jīng)累積了一整套進樣和樣品預(yù)處理技術(shù)，它們是芯片實驗室發(fā)展的重要基礎(chǔ)。

利用芯片平臺處理樣品，首先需要將樣品引入芯片的樣品處理通道或通道網(wǎng)絡(luò)，該步驟通常稱為進樣(sample loading)。進樣通常又可分為上樣和取樣兩個步驟。芯片樣品處理通道粗細與人類的毛發(fā)相若，如何將樣品從外部宏觀世界以可控的方式引入微觀通道內(nèi)部一直是芯片實驗室領(lǐng)域的一個研究熱點(圖5-1)。

進樣是芯片實驗室的關(guān)鍵技術(shù)之一，引入樣品的量、形態(tài)和方式等均會對后續(xù)樣品處理產(chǎn)生影響，因芯片體系微小，這種影響有時甚至是決定性的。穩(wěn)定、可靠的進樣是芯片實驗室產(chǎn)業(yè)化的必要條件之一。

待進樣的樣品可存儲于芯片上的儲液池，從儲液池進樣快捷，但樣品容量偏低。樣品也可存儲在芯片外，此時樣品通過導(dǎo)管進入芯片(圖5-2(a))。外置樣品源容量大，可滿足長時間連續(xù)進樣。

芯片進樣可由電場、注射泵、靜壓力、表面張力等不同的方式驅(qū)動(圖5-2 (b))。一般意義上的進樣通常針對液態(tài)樣品，氣態(tài)樣品也可直接進樣，固態(tài)樣品在微粒化后，經(jīng)過液/氣流攜帶也可被引入芯片樣品處理通道。

(a) 兩種進樣模式示意:()儲液池模式(樣品存儲在芯片儲液池內(nèi)，由儲液池進入芯片微通道);(I) 導(dǎo)管模式(樣品存儲在芯片外，由導(dǎo)管引入芯片微通道);(b)四種進樣驅(qū)動方式示意(I)電場驅(qū)動模式(電極置入微通道兩端的儲液池中，所產(chǎn)生的電場即可驅(qū)動微通道中的液體)，(I)注射泵驅(qū)動模式，(Ⅲ)靜壓力驅(qū)動模式(液體從高液位芯片儲液池流向低液位芯片儲液池)，(IV)表面張力驅(qū)動模式(微通道內(nèi)彎曲液面所產(chǎn)生表面張力可作為流體驅(qū)動力)

5.1 液態(tài)樣品進樣

芯片實驗室處理的對象是流體，液態(tài)樣品進樣是芯片進樣的主流，實際中主要有三種情形:向樣品處理通道內(nèi)引入樣品區(qū)帶，引入樣品液滴和引入持續(xù)樣品流。

5.1.1 區(qū)帶樣品進樣

向芯片樣品處理通道內(nèi)引入樣品區(qū)帶是芯片電泳、芯片色譜、芯片電色譜等芯片實驗室重要單元操作實施的先決條件。樣品區(qū)帶的量、長度等

指標(biāo)對于單元操作的結(jié)果有重大影響。如何向通道內(nèi)引入可控樣品區(qū)帶自微流控芯片概念提出以來一直是一個研究熱點。

5.1.1.1 單通道輔助進樣

經(jīng)樣品源向芯片樣品處理通道內(nèi)輸入樣品區(qū)帶通常需要其他手段輔助，最簡單的方法是設(shè)置一條輔助通道，該法被稱為單通道輔助進樣，通常分兩步，上樣和取樣(圖5-3)。

圖5-3 單通道輔助進樣

(a)進樣過程示意和對應(yīng)的熒光顯微照片:(I)上樣:將樣品從樣品源引入輔助通道，在十字交叉口處形成一區(qū)帶;(II)、(III)取樣:將十字交叉口處區(qū)帶引入樣品處理通道，通過十字交叉口的幾何尺寸控制區(qū)帶的長度和量;(b)典型的單通道輔助進樣芯片設(shè)計

單通道輔助進樣按上樣和取樣的驅(qū)動力的不同可分為完全電動單通道輔助進樣、完全壓力單通道輔助進樣和壓力電動單通道輔助進樣等幾種。

完全電動單通道輔助進樣

完全電動單通道輔助進樣簡稱電動進樣，指的是一種僅以電動力(包括電泳力和電滲力)為驅(qū)動力，通過電壓切換，在十字交叉處形成樣品區(qū)帶并將其引入樣品處理通道的方法。電動進樣操作簡便，易于實施，是目前主流的單通道輔助進樣技術(shù)。

依據(jù)電壓施加策略的不同，這種進樣方式又可分為簡單進樣、懸浮進樣、壓縮進樣和門進樣等(圖5-4)。

圖5-4 各種電動進樣方法原理示意

(a)簡單進樣;(b)懸浮進樣;(c)壓縮進樣;(d) 門進樣存儲不同溶液的芯片儲液池，1.樣品池，2.樣品廢液池，3.緩沖液池，4.緩沖液廢液池

簡單進樣和懸浮進樣方法上樣和取樣都只涉及單方向電場，操作簡單，在預(yù)實驗中較常用(懸浮指的是電極不施加電壓的狀態(tài))，壓縮進樣方法涉及多方向電場，可較好地控制樣品區(qū)帶的量和長度，在實際中使用較多(圖5-3(a)熒光照片所示即為壓縮進樣過程)。門進樣方法可向樣品處理通道內(nèi)連續(xù)輸入?yún)^(qū)帶，缺點在于輸入?yún)^(qū)帶的形態(tài)不甚規(guī)則。所有電動進樣方法均服從基爾霍夫定律，即在任一時刻，各段流路內(nèi)的電場強度的矢量和等于零。在圖5-5所示的十字芯片中，基爾霍夫定律可表達為E1+E3+E2+E4=0。

電動進樣的主要缺點是其存在一種進樣歧視效應(yīng)，指的是一種因樣品中各組分電動性質(zhì)相異而導(dǎo)致樣品區(qū)帶不能代表實際樣品組成的現(xiàn)象，其具體機理因進樣類型而異且在上樣和取樣階段同時存在。在上樣階段，門進樣因進樣量與上樣時間有關(guān)，歧視效應(yīng)發(fā)生的機理為，在相同進樣時間內(nèi)，因不同組分的電動淌度相異，淌度大的組分進樣量大，淌度小的組分進樣量小，是一種淌度電歧視。而對簡單進樣、懸浮進樣和壓縮進樣而言，理論上只要上樣時間足夠長，保證所有組分均通過十字交叉口則上述淌度電歧視效應(yīng)可避免，但研究表明上樣過程中溶液離子強度的變化和因電極附近緩沖液的電解所產(chǎn)生的流體系統(tǒng)pH值漂移也可誘導(dǎo)一定的歧視效應(yīng)。較之上樣階段，對取樣階段電歧視的研究則相對滯后，目前了解的情況是這種電歧視與樣品組分分子所帶電荷的種類及上樣通道與分離通道的寬度比有關(guān)。

此外，門進樣除存在淌度電歧視外，還存在彎角電歧視，因此不推薦其作為復(fù)雜樣品定量分析的進樣方法。彎角電歧視指的是由于樣品各組分電動淌度不一致，使其自身在經(jīng)過十字交叉時因轉(zhuǎn)彎半徑不一致所引起的歧視效應(yīng)。

完全壓力單通道輔助進樣

僅利用壓力將樣品區(qū)帶引入樣品處理通道的方法稱為完全壓力單通道輔助進樣，簡稱壓力進樣(圖5-6)。

圖5-6壓力進樣方法原理示意

(a) 預(yù)備狀態(tài)、(b)上樣，(c)取樣，通過(b)、(c)之間的反復(fù)切換可實現(xiàn)連續(xù)進樣

壓力作用下流體的行為與樣品組成、管壁帶電狀況等基本無關(guān)，因此壓力進樣方法所引入的樣品區(qū)帶在很大程度上可代表樣品中各組分的真實組成，但向微通道內(nèi)施加壓力操作比較繁雜，所需設(shè)備也較精密和昂貴，有一定的技術(shù)門檻，此外，壓力進樣方法并不涉及電場，因此，完全壓力單通道輔助進樣方法的實際應(yīng)用面較狹窄，主要集中于芯片液相色譜類操作。

壓力電動單通道輔助進樣

壓力電動單通道輔助進樣是一種上樣驅(qū)動力為壓力，取樣驅(qū)動力為電動力的進樣方法，簡稱壓力電動進樣。典型案例是作者課題組開發(fā)出的一種靜壓力電動進樣方法(圖5-7)。

圖5-7靜壓力電動進樣方法(示意圖和熒光顯微照片)

壓力電動進樣方法因采用壓力上樣而使樣品區(qū)帶能夠代表樣品中各組分的真實組成，又因采用電動取樣而與芯片電泳、電色譜等重要芯片實驗室單元操作兼容。類似于完全壓力進樣，壓力電動進樣的推廣受限于壓力上樣的技術(shù)門檻，但因產(chǎn)生壓力的方式多種多樣，該法在一段時期內(nèi)是科學(xué)研究的熱點之一，除靜壓力電動進樣方法外，其它種類的壓力電動進樣方法還有注射泵致壓力電動進樣[7]、氣動微泵致壓力電動進樣等。

樣品池、緩沖液池、緩沖液廢液池和樣品廢液池內(nèi)溶液的體積分別為13、10、10和2μL。(a)預(yù)備狀態(tài)(施加電場使緩沖液從緩沖液池流向樣品廢液池，形成一個“門”，樣品在靜壓力作用下從樣品池流向樣品廢液池，在“門”的作用下，樣品不能進入樣品處理通道);(b)上樣(將緩沖液池和樣品廢液池切換為懸浮狀態(tài)，樣品即在樣品池與緩沖液廢液池間的靜壓力作用下進入樣品處理通道);(c)取樣(上樣30s后，恢復(fù)預(yù)備狀態(tài)電壓設(shè)置，一段樣品區(qū)帶便被導(dǎo)入至樣品處理通道);(d)上樣熒光顯微照片;(e)取樣熒光顯微照片

5.1.1.2 多通道輔助進樣

設(shè)置多條輔助通道，向樣品處理通道內(nèi)輸入樣品區(qū)帶的方法稱為多通道輔助進樣。典型案例包括雙十字靜壓力進樣方法[1(圖5-8)、雙十字電動進樣法、多T電動進樣法等。

圖5-8所示即為作者課題組開發(fā)的雙十字靜壓力電動進樣法。在原有十字交叉結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上增加了一個十字交叉結(jié)構(gòu)，雙十字間距離十分接近，從幾微米至幾十微米不等。上樣時，樣品廢液池置空，其余儲液池內(nèi)則加入一定體積的溶液，在靜壓力驅(qū)動下，樣品從樣品池1經(jīng)橋流入樣品廢液池，待兩個十字交叉口處充滿樣品后，在輔助通道2和分離通道內(nèi)同時施加相同大小的電場實施取樣，分離通道十字交叉口內(nèi)的樣品在電場作用下流入分離通道，形成樣品區(qū)帶，而來源于樣品池的靜壓力樣品流則被電場經(jīng)十字交叉口轉(zhuǎn)入輔助通道2，不會流入分離通道干擾隨后的電泳分析，如圖5-8 (a)所示。

由于兩條輔助通道的設(shè)置，雙十字靜壓力進樣方法可對樣品區(qū)帶實施精細調(diào)節(jié)，實驗表明，對于羅丹明123樣品，在一定范圍內(nèi)，進樣量和所加旁路電場大小呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，如圖5-8(b)所示。這種線性關(guān)系在熒光素納樣品上也得到證實。

圖5-8 雙十字靜壓力進樣法

在圖5-9(a) 和(b)中，其進樣所需的電極數(shù)可被降至兩個。該法的缺點是芯片微通道網(wǎng)絡(luò)設(shè)計稍顯復(fù)雜。

電極數(shù)目與芯片電泳儀的搭建難度、成本，電泳實驗操作難度關(guān)系密切。芯片電泳儀所需電極的最小數(shù)目為二。因此，兩電極雙十字靜壓力進樣法可將芯片電泳儀的搭建難度和成本降至最低，同時降低電泳實驗操作難度，便于芯片電泳技術(shù)的推廣和普及。

兩電極雙十字靜壓力進樣法還可降低陣列芯片電泳進樣所需電極數(shù)，最低也可降至兩個(圖5-9 (c))。

圖5-9 雙十字靜壓力進樣方法對電極數(shù)目的減小作用

(a)雙十字靜壓力進樣方法:由四電極到兩電極;(b)基于兩電極雙十字靜壓力進樣方法的蛋白質(zhì)電泳譜圖;(c)兩種基于兩電極進樣設(shè)計的陣列電泳芯片及對應(yīng)的染料陣列電泳譜圖

5.1.1.3 激光輔助進樣

若樣品帶有熒光且采用熒光法檢測，可不設(shè)輔助通道，而利用強激光對樣品的漂白作用直接在分離通道內(nèi)形成樣品區(qū)帶。該法實質(zhì)上是一種門進樣，“門"為強激光束。如圖5-10所示。大功率的激光束被分光器分為能量不同的兩束，其中能量大(75-750mW)的作為“門”光束被聚焦到通道上游靠近樣品池處，能量小(2mW)的光束則被聚焦到通道下游作為檢測光束。在上樣開始前，樣品在通道兩端電場的作用下持續(xù)流出樣品池，在通道上游流經(jīng)大能量“門”光束時，經(jīng)其漂白變?yōu)榉菬晒饣衔铮⑴c緩沖液一起流經(jīng)檢測光束，在電泳譜圖上形成基線。這種情形等效于“門”處于關(guān)閉狀態(tài)。上樣時，由一光閘擋住"門”光束，“門"隨即開啟，一段熒光樣品因未被漂白而進入下游分離通道，形成樣品區(qū)帶。“門”開啟的時間越長，進樣量越大。類似于前述幾種門進樣方法，光門進樣同樣可連續(xù)進樣且速度較快，此外芯片設(shè)計簡單，易于陣列化，但因激光不能完全漂白熒光化合物而導(dǎo)致其基線噪音較大，檢測限偏高。

圖5-10 激光輔助進樣(a) 原理示意;(b)典型的連續(xù)進樣譜圖

5.1.2 液滴樣品進樣

液體可以以不連續(xù)微小液滴的形式存在于與之不相溶的另一種液體中，這種兩相體系稱之為乳液(emulsion)。乳液既與人類的生活密切相關(guān)，又是科學(xué)研究的一個重要平臺。日常用的化妝品很多便以乳液狀態(tài)存在，而乳液中微小的液滴又可以支撐多種生化研究，甚至有科學(xué)家提出了“液滴實驗室”的概念。如何向芯片樣品處理通道內(nèi)引入液滴成為芯片進樣領(lǐng)域研究的一個熱門課題。

以連續(xù)液滴為特征的微流控芯片稱為液滴微流控芯片(圖5-11)。液滴微流控芯片是芯片實驗室領(lǐng)域的一個重要分支。本書第8章將對該分支做詳細介紹。

當(dāng)油相和水相流動速率之比為合適數(shù)值時，從T型交叉口處可以向樣品處理通道連續(xù)輸出液滴;當(dāng)樣品處理通道為蛇形時，液滴在遷移時內(nèi)部存在一個自動混合過程

5.1.3 連續(xù)樣品進樣

將液體持續(xù)導(dǎo)入至樣品處理通道稱為為連續(xù)樣品進樣。連續(xù)樣品進樣是芯片有機合成、液液萃取、細胞培養(yǎng)等領(lǐng)域的一項基礎(chǔ)技術(shù)。理論上，只要樣品源與微通道連通，輔以持續(xù)的驅(qū)動力，就可以實現(xiàn)連續(xù)樣品進樣。實際中，一個大的挑戰(zhàn)在于如何方便快捷地實現(xiàn)持續(xù)、穩(wěn)定、自動化的連續(xù)樣品進樣。

作者所在實驗室開發(fā)出一種基于”表面張力-蒸發(fā)”平衡效應(yīng)的連續(xù)進樣方法(圖5-12)，該法在不需要芯片外部設(shè)備，控制軟件和動力源的條

件下實現(xiàn)了持續(xù)、穩(wěn)定、自動化的連續(xù)樣品進樣，而且進樣裝置的體積和成本都極小，操作也無需專業(yè)技巧。該進樣方法很可能在家庭化的芯片實驗室中得到廣泛應(yīng)用，對芯片實驗室產(chǎn)業(yè)化也有一定的促進作用。

圖5-12 基于“表面張力-蒸發(fā)"平衡效應(yīng)的連續(xù)進樣方法

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