自微流控芯片問世以來，檢測器研究一直是人們關注的熱點。微流控芯片中各種生物和化學過程通常是在微米量級的通道幾何結構內完成的，因此，要求其檢測器具有靈敏度高、響應速度快、微型化等特點。

熒光檢測(FluorescencedetectionFD)技術因具有準確度好、靈敏度高等特點，是目前微流控系統最常用的檢測技術之一。微流控芯片的主要研究對象如蛋白質、脫氧核糖核酸及氨基酸等自身帶有熒光基團、或者衍生化后可產生熒光均可采用熒光檢測技術，檢出限達10-14mol·L-1甚至可檢測到單個DNA分子液芯波導管的引入使檢測系統的性能大有改善。本文就目前微流控芯片熒光檢測系統的研究進展進行綜述主要介紹用于微流控芯片的激光誘導熒光(LIF)、發光二極管(LED)誘導熒光和其他熒光檢測方法和裝置以及它們的具體應用。

１熒光檢測系統概述

許多化合物如有機胺、維生素、激素、酶等被入射光（即激發光）照射，吸收一定波長的光后，分子中的某些電子從基態向較高能級躍遷，電子之間發生碰撞消耗部分能量而無輻射地降到第一電子激發態的最低振動能級，再回到基態的不同振動能級，同時發射出比吸收光波長更長的熒光。熒光強度與入射光強度、量子效率、樣品濃度成正比。

要實現高靈敏度的熒光檢測，關鍵在于降低背景光，特別是激發光背景的影響。因此檢測系統的光路結構設計十分重要，目前報道的有正交型、非共焦型、共聚焦型和平行型等（表１）。常用的光學元件包括光源、透鏡、濾光片、分色鏡、光纖、物鏡、光電轉換元件等。

由于研究對象和技術方法等實際情況的差異，不同的研究小組在光路的設計、光學元件的配置上各有不同。

表１微流控芯片熒光檢測系統的４種光路結構比較

２激光誘導熒光檢測系統

激光具有能量高、方向性好、易聚焦等特點，特別適合作為微流控芯片中熒光檢測器的光源，以提高檢測的靈敏度。激光誘導熒光（ＬａｓｅｒＩｎｄｕｃｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＬＩＦ）檢測是目前最靈敏的檢測方法之一，其檢出限一般在１０－１２～１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１之間，最低可達１０－１４ｍｏｌ·Ｌ－１。采用一些改進技術（如光子記數、雙光子激發等）對于某些熒光效率高的物質甚至可達單分子檢測，ＬＩＦ檢測法還具有良好的選擇性和較寬的線性范圍。早期使用的光源是氬離子激光器，具有功率大、輸出穩定、匯聚效果好的優點，但其體積龐大，不利于儀器微型化，已逐漸被半導體激光器取代。半導體激光器功率輸出穩定，價格較低、體積較小、壽命長。

單通道芯片ＬＩＦ檢測

單通道微流控芯片激光誘導熒光檢測器是人們研究最早，也是目前研究較成熟、應用廣泛的一類ＬＩＦ檢測器，但此類裝置大多是研究者自行搭建，缺乏商品化的儀器。Ｏｃｖｉｒｋ等以４８８ｎｍ氬離子激光器為激發光源，采用共聚焦光路以降低背景噪音，在玻璃芯片上對熒光素的檢出限分別達到３００ｆｍｏｌ·Ｌ－１（連續流動模式，Ｓ／Ｎ＝６．１）和１ｐｍｏｌ·Ｌ－１（區帶電泳模式，Ｓ／Ｎ＝５．８）。林炳承等研制了一種通用型激光誘導熒光微流控芯片分析儀，采用電荷耦合器件（ＣＣＤ）監測通道，三維調節聚焦，發射波長濾光片可方便地更換以適應多種染料選擇，以羅丹明６Ｇ熒光試劑作為檢測物質，檢出限為６．６７×１０－１３ｍｏｌ·Ｌ－１。

通過采用多種方法，可以進一步提高其檢測靈敏度。如Ｅｆｆｅｎｈａｕｓｅｒ等通過光子計數技術，對ＰＤＭＳ芯片電泳分離的６０３ｂｐＤＮＡ片段進行檢測（ＹＯＹＯ－１標記），檢出限達到了１０－２１ｍｏｌ水平。而Ｆｉｓｔｅｒ等采用單光子雪崩二極管（ＳＰＡＤ）作為檢測元件，利用雙脈沖計數法，對經芯片電泳分離的羅丹明６Ｇ和羅丹明Ｂ的檢出限分別達到１．７×１０－１５ｍｏｌ·Ｌ－１和８．５×１０－１５ｍｏｌ·Ｌ－１，分離時間小于３５ｓ，相對遷移時間的不確定性小于２．０％。Ｆｕ等［１７］采用正交型的光路結構，在微流控芯片系統中使用一個簡單的ＬＩＦ檢測器，從芯片側壁檢測微通道中激發的熒光，以減少來自光源的散射光干擾，從而達到高靈敏度檢測的目的。此項研究利用芯片上激光的散射光強度分布的顯著差異，接收光信號時避開散射光以達到信噪比（Ｓ／Ｎ）的最大優化。熒光接收角度為４５°時結果最佳，所接收的散射光強度僅為接收角度為９０°時散射光強度的１／３８。以熒光素鈉和異硫氰酸熒光素標記的氨基酸為樣品進行檢測，檢出限達１．１×１０－１２ｍｏｌ·Ｌ－１（Ｓ／Ｎ＝３），與優化后的微流控芯片共聚焦ＬＩＦ系統性能相當。

采用半導體激光器作為激發光源，可大大減?。蹋桑茩z測器的體積、重量和功耗，從而適于搭建微型化分析系統。Ｓｈｒｉｎｉｖａｓａｎ等使用波長為６３５ｎｍ的紅色半導體激光器作為光源，研制了一種低成本、低功耗的小型熒光檢測器，光電二極管加上運算放大器進行信號采集。該系統功率僅２７０ｍＷ，與傳統使用氬離子激光器和光電倍增管的檢測系統相比，成本減少了９８％，能耗只有傳統的１／５０００。在微分析系統中，采用此微型ＬＩＦ檢測器進行ＤＮＡ定量分析，誤差小于１５％。

多通道陣列芯片ＬＩＦ檢測

隨著微機電加工技術的發展，人們已經實現在芯片上加工出上百條并行的微通道，進行高通量的反應和分離，以滿足藥物篩選和基因測序等領域的需求。對陣列微流控芯片進行快速高靈敏度的檢測，促進了微流控芯片實驗室技術向通量化方向發展。

采用多道掃描熒光檢測技術，可以在陣列式微流控芯片上實現高通量、高速度的檢測分析。Ｓｈｉ等設計了一種旋轉掃描的共聚焦激光誘導熒光四色檢測器，用于９６通道圓盤式毛細管陣列電泳芯片分析的檢測。檢測器的掃描物鏡頭在步進電極的帶動下，依次對芯片上各通道的檢測點進行熒光檢測，利用共聚焦光路系統將激發光和熒光分開，熒光信號由二個四色檢測裝置進行檢測。該檢測器可在１２０ｓ內完成芯片上９６個通道和３８４個通道中ＤＮＡ片段的高通量快速熒光分析，測序速度達到１．７ｋｂｐ·ｍｉｎ－１，比目前商用毛細管陣列電泳測序技術快５倍。該系統適用于低濃度、試劑量少的樣品，且在樣品的制備處理方面表現出許多優勢，有可能成為下一代高性能ＤＮＡ測序平臺。

采用電荷耦合器件（ＣＣＤ）作為檢測器是多通道陣列芯片的另一種檢測方式。Ｓｈｅｎ等采用４７３ｎｍ半導體固體激光器作為光源，激發光束經凹面鏡匯聚、柱面鏡擴展成一條寬４ｍｍ的線狀激光后，濾去雜光聚焦于芯片陣列通道上，激發微通道中的熒光物質產生熒光。發出的熒光經過收集、濾過雜散光后進入ＣＣＤ檢測。Ｏｋａｇｂａｒｅ等用波長為６６０ｎｍ的激光作激發光源，電子倍增電荷耦合器件（ＥＭＣＣＤ）轉換光電信號，在３０通道的微芯片上進行單分子熒光檢測。該檢測系統對熒光標記的單個ＤＮＡ分子具有足夠的靈敏度，檢測速率達到４．０２×１０５個·ｓ－１。將通道變窄，縮短間距，可進一步提高檢測速度。ＭｃＫｅｎｎａ等構建了一個高通量細胞計數微流控芯片系統，可在６～１０ｍｉｎ內對３８４份樣品進行細胞篩選。Ｇａｒｃｉａ－Ａｌｏｎｓｏ等使用倒置顯微鏡檢測熒光，在８通道的微芯片上進行化合物的毒性篩選。Ｃｈｅｎ等建立了一種快速、超靈敏的檢測方法，在５ｍｉｎ內可完成對７－氨基氯硝西泮（７－ＡＣＺＰ）的檢測，線性范圍為１．１～６０．１μｇ·Ｌ－１，檢出限為０．０２１μｇ·Ｌ－１。Ｅｍｏｒｙ等使用ＣＣＤ相機延時合成（ＴＤＩ）模式，對多條微流體通道同時進行單分子的跟蹤和檢測，可實現每秒１．７×１０７個的高通量檢測。

３發光二極管誘導熒光檢測系統

在半導體激光器發展的同時，半導體發光二極管（ＬＥＤ）也日益受到重視。ＬＥＤ是一種體積更小，壽命更長、價格更低的發光器件，能極大地簡化檢測器的結構。目前，多種波長的高亮度ＬＥＤ已上市，利于實現對各種生物樣品、金屬離子及中藥提取物的熒光檢測。

為了減少激發光干擾，ＬＥＤ誘導熒光檢測系統光路多為正交型。Ｎａｋａｊｉｍａ等采用ＬＥＤ、兩個圓柱型透鏡、一棱鏡及一分色鏡、電荷耦合器件（ＣＣＤ）、聚合物芯片等組建了微芯片傳感器，實現了低分子物質的在線分析。Ｘｕ等采用共聚焦光路結構，先通過聚合酶鏈反應（ＰＣＲ），然后在芯片毛細管電泳上用４９０ｎｍ的ＬＥＤ作激發光源，進行雙鏈ＤＮＡ片段一步測定。關亞風等研制了一種ＬＥＤ誘導熒光檢測系統，通過柱上檢測可與微通道分析系統在線聯用，對ＦＩＴＣ標記的苯丙氨酸濃度檢出限達１．０×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１。Ｐａｉｓ等使用綠光ＬＥＤ作為光源、兩塊偏振鏡分別過濾激發光與發射熒光，建立了一種高靈敏度的熒光分析方法，對羅丹明６Ｇ和熒光素的檢出限分別為０．１μｍｏｌ·Ｌ－１和１０μｍｏｌ·Ｌ－１。

以光纖作為傳光介質，能夠減小光斑的直徑，起匯聚作用。美國哈佛大學Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ課題組報道了一種ＰＤＭＳ芯片，該芯片中集成有熒光檢測單元，分為三層：通道層靠近分離通道的邊緣埋有一根光纖，光纖通過與外部４７３ｎｍ的ＬＥＤ耦合以傳輸激發光；底層ＰＤＭＳ基片中埋入微型雪崩二極管（μＡＰＤ）作為感光元件，表面覆蓋一層ＰＣ聚合物濾光片。該系統對熒光素的檢出限為２．５×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１，且被成功地用于蛋白質和小分子混合物的電泳分離和檢測。崔大付等在光纖型微流控芯片上建立了用藍色ＬＥＤ誘導熒光檢測系統。ＬＥＤ激發光通過連接在芯片上的光纖傳遞，到達檢測區域，利于實現儀器的微型化，對ＦＩＴＣ的檢出限（５Ｓ／Ｎ）達２２ｎｍｏｌ·Ｌ－１。Ｕｃｈｉｙａｍａ等將藍色ＬＥＤ直接埋入上層聚酯蓋片中，在與ＬＥＤ垂直的下層聚酯芯片的通道側旁固定一多模光纖以收集熒光，將其直接導入光電倍增管中進行檢測。

由于光纖纖芯直徑（一般為６２．５μｍ）與微流控溝道的深度尺寸（５０～１００μｍ）非常接近，同時用于激發光的傳輸和熒光信號的采集，提高激發效率和檢測靈敏度。Ｄｅｓｔａｎｄａｕ等將刻有Ｙ形通道的ＰＤＭＳ板固定在玻璃基板上，用ＬＥＤ作激發光源，兩根光纖分別用于激發光的傳導和熒光的收集。對水溶液中鉀離子的濃度進行檢測，檢出限為０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，且不受鈉離子的干擾。Ｉｒａｗａｎ等用藍色ＬＥＤ、ＰＭＭＡ或石英材料的光纖和小型光電倍增管搭建了一個緊湊型的熒光檢測系統，能夠檢測到磷酸鹽緩沖溶液中０．００５ｍｇ·Ｌ－１的熒光素，結果可重復。將該系統應用于多通道檢測，對熒光素的檢出限達到０．０１ｎｇ·Ｌ－１，重現性良好，相鄰通道間未觀察到相互干擾的現象。該系統還可應用于芯片上的免疫檢測。Ｈｕｏ等用三種不同波長的發光二極管組成陣列作為熒光檢測的激發光源，通過光纖束傳導激發光，實現了對不同熒光物質的同時檢測。

使用液芯波導技術，是提高熒光檢測靈敏度的另一種有效方法。Ｄａｓｇｕｐｔａ等最先使用ＴｅｆｌｏｎＡＦ－１６００材料涂覆的毛細管作為液芯波導管，實現毛細管電泳中的熒光檢測。Ｗａｎｇ等在微流控芯片上利用ＬＥＤ作為激發光源，結合液芯光纖波導池傳輸熒光，有效地減小了激發光干擾。以波長４７０ｍｍ的ＬＥＤ為激發光源，用液芯波導Ｈ－通道微芯片與流動注射聯用，對ＦＩＴＣ衍生精氨酸的檢出限為１．６ｆｍｏｌ，實現了微流控芯片分析系統中的ＬＥＤ－液芯波導誘導熒光檢測。在此基礎上使用同步雙波長調節，提高了檢測的信噪比。

光波導元件的芯片集成對提高ＬＩＦ檢測單元在微流控芯片上的集成度具有重要意義。通過常規刻蝕手段在平板芯片上形成可定向排列的波導結構，以提高其檢測通量和微型光學元件排列的緊湊性。如Ｍｏｇｅｎｓｅｎ等在一塊芯片上刻蝕一系列并行的光波導結構，可將一束激光分成１２８道平行光束，而且僅需一個光電倍增管（ＰＭＴ）就可同時檢測所有波導通道。他們利用該芯片測定了熒光微粒在微通道中的流速。趙琰等提出了一種液芯波導免疫分析陣列芯片的檢測系統，結合光強差技術提高了ＥＬＩＳＡ的靈敏度，辣根過氧化酶（ＨＲＰ）的線性范圍為１×１０－１０～９×１０－１０ｇ·Ｌ－１，檢出限為３．０×１０－１１ｇ·Ｌ－１，相對標準偏差小于１％，線性范圍的下限與檢出限均比普通的光度法改善了１００倍，將其應用于血清和尿液中β２－微球蛋白的免疫分析，與標準方法所得結果相符。Ｂｌｉｓｓ等將熒光染料摻入ＰＤＭＳ材料中，通過調節極性控制染料分子的擴散入液芯波導管程度，這些分子選擇性地吸收激發光并傳送被測樣品發出的熒光，以此進行ＤＮＡ片段的分析與檢測。

與常規的ＬＩＦ檢測器相比，目前，這種集成化熒光檢測器的檢測靈敏度要低一些，除了ＬＥＤ光強較弱外，還因為所用的ＬＥＤ光源光譜通帶較寬，其半帶寬通常為２０～３０ｎｍ，導致很難將激發光與熒光有效地分離。Ｒｅｎ等開發了一種新型的便攜式熒光檢測系統，應用在微流控陣列芯片上。該系統極其簡單，使用一個掃描ＬＥＤ光源和一個單點光電傳感器，無ＣＣＤ、透鏡、光纖或其他活動部件。脈沖驅動ＬＥＤ使靈敏度大大提高，并極大地減少能耗、降低光漂白效應。與傳統的毛細管陣列電泳檢測系統不同的是，目前該系統能以高掃描率掃描徑向的毛細管陣列。用８通道的陣列芯片系統檢測ＦＩＴＣ標記的精氨酸試樣，檢出限可達６４０ａｍｏｌ。

隨著微型激光二極管等高質量光源的發展，這種微型化的熒光檢測器將對微流控芯片的推廣以及最終被公眾廣泛接受起著十分重要的作用。

４其他熒光檢測系統

雙光子激發熒光檢測的特點是背景散射光的干擾小，信噪比高，由于熒光激發效率平方與入射光強平方成正比關系，探測靈敏體積被限制在焦點附近，更有利于實現單分子探測。Ｚｕｇｅｌ等首次在芯片上實現了雙光子激發熒光檢測。采用平均功率１２０ｍＷ、發射波長５８０ｎｍ的染料激光器作激發光源，共聚焦的熒光顯微鏡為光學系統，時間相關的單光子計數器作為熒光檢測部件，構成了雙光子激發熒光檢測器，對熒光素標記的β－萘胺檢出限達６．０×１０－８ｍｏｌ·Ｌ－１。Ｓｃｈｕｌｚｅ等使用４２０ｎｍ的激發光，在微流控芯片上實現了對天然蛋白和小分子芳烴的雙光子激發熒光檢測，檢出限達１．０×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１。

Ｄｏｎｇｒｅ等采用直接飛秒激光刻寫技術將光學波導管集成到普通石英微流控芯片上，通過光波導管傳導連續激光器發出的入射光，對經微流控芯片分離的、帶有熒光標記的ＤＮＡ分子進行檢測；同一課題組的Ｍａｒｔｉｎｅｚ等采用高數值孔徑光纖，以９０°收集激發產生的熒光，通過簡單的后處理和規范化的技術將光子功能集成到微流控芯片上。運用先進而獨特的三維飛秒激光刻寫技術，可實現如分束鏡或馬赫－貞德干涉儀等更加復雜的功能，該裝置結構緊湊、方便攜帶，克服了目前微流控芯片檢測系統檢測元件體積較大等缺點。Ｋａｍｅｉ等報道了一種微型集成熒光檢測器，對常用的熒光標記染料有較高的靈敏度，適用于即時檢測（ＰＯＣＴ）。Ｂｕｎｙ－ａｋｕｌ等以ＳＲＢ作熒光染料，在微芯片熒光檢測系統上檢測霍亂弧菌毒素Ｂ亞基（ＣＴＢ），檢出限為６．６μｇ·Ｌ－１。Ｗｕ等在微芯片上實現了粒子計數與熒光檢測同步進行，可以檢測到直徑０．９μｍ的熒光粒子。Ｓｃｈｕｌｔｚ等報道了一種新型的熒光陣列生物傳感檢測器，成功地應用于ＤＮＡ雜交分析。

單一的檢測方法具有局限性。將熒光檢測與其他方法聯用進行雙重檢測，可以得到化合物的更多信息，同時測定不同性質的各種物質，幫助確證峰的歸屬。Ｌｉｕ等搭建了一種熒光／非接觸電導雙重檢測器。在芯片微通道上進行熒光和非接觸電導同點同步檢測，對熒光素納、ＦＩＴＣ和ＦＩＴＣ標記的精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸的熒光檢測，檢出限分別為０．０２，０．０５，０．１６，０．１５，０．１２μｍｏｌ·Ｌ－１，對Ｄ－青霉胺的檢出限為１．１μｍｏｌ·Ｌ－１。Ｌａｐｏｓ等報道了一種在微流控芯片上同時進行安培／熒光雙檢測的方法。對多巴胺、兒茶酚、ＮＢＤ－精氨酸與ＮＢＤ－苯丙氨酸熒光檢測的檢出限分別為０．４４８，１．５２，１６，１８μｍｏｌ·Ｌ－１。

５展望

熒光檢測技術為微流控芯片分析研究提供了更為靈敏的檢測手段。多通道陣列芯片上熒光檢測系統，將滿足藥物篩選和基因測序等領域高通量的需求。超高亮度ＬＥＤ的面世以及使用脈沖電源供電方式增加ＬＥＤ激發光強、聯合液芯波導技術的應用，以及與其他檢測技術聯用等措施，能夠進一步提高靈敏度，降低檢出限，擴大應用范圍。

微流控分析技術自２０世紀末興起后，取得了迅速的發展。但目前商品化的熒光檢測器，在不同程度上存在著價格昂貴、維護費用高、兼容性差等局限性。因此，研制成本低廉、集成度高、適合于商品化的微流控芯片熒光分析儀，成為當前分析儀器發展的重要目標之一。

（文章來源:張雯，錢金雄，肖彥革，陳纘光*《微流控芯片熒光檢測系統研究進展》科學網科學網轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）